ПЦР это аббревиатура для обозначения полимеразной цепной реакции, которая является основным методом молекулярной биологии.
По существу, основной целью полимеразной цепной реакции является быстрое увеличение количества копий определенных участков ДНК.
Метод состоит из 3 основных ПЦР этапов и относительно несложной реакционной смеси.
Продукт ПЦР выступает в качестве средства для дальнейшего анализа. Например, амплификат используется в гель-электрофорезе для обнаружения различных последовательностей ДНК.
Сегодня различные виды ПЦР, в сочетании с другими технологиями, находят многочисленные приложения в таких областях, как судебная медицина, сельскохозяйственные науки, медицина и т. д. Метод полимеразной цепной реакции используется для диагностики заболеваний, клонирования и секвенирования генов.
ПЦР-амплификацию можно проводить с использованием ДНК из различных источников. Это очень чувствительный метод и для получения количества копий достаточного для обычного лабораторного анализа требует только следовых количеств ДНК.
ПЦР повышает количество фрагментов матричной ДНК
3 основные стадии ПЦР амплификации ДНК
Полимеразная цепная реакция представляет собой трехстадийный циклический процесс, состоящий из определенных этапов, различающихся между собой по времени проведения и температуре.
3 основных этапа ПЦР включают:
- шаг денатурации (denaturation);
- этап отжига (annealing);
- шаг элонгации (удлинения или синтеза, elongation).
Каждый из этих шагов повторяется 30-40 раз (циклов).
В течение каждого цикла реакционная смесь подвергается воздействию трех разных температур.
Температурный профиль 3 основных стадий ПЦР
Во время последовательных циклов основных этапов ПЦР (денатурация, отжиг и элонгация) все новосинтезированные нити ДНК будут действовать как шаблоны, вызывая экспоненциальное увеличение количества производимой ДНК.
Каждый цикл удваивает количество молекул ДНК (ампликонов), синтезируемых из ДНК шаблона.
Этап ПЦР денатурации
Первым из трех стадий ПЦР является этап денатурации.
Во время стадии денатурации водородные связи, которые удерживают вместе две нити двухцепочечной ДНК, разрушаются, и эти нити расходятся друг от друга.
Этот процесс высвобождает одноцепочечную ДНК, которая выступает в качестве ДНК матрицы на этапе элонгации.
Температура денатурации устанавливается выше 90°C (обычно 94°C). Продолжительность этой стадии может доходить до одной минуты (обычно 30 секунд).
Этап ПЦР отжига
На стадии отжига праймеры выстраиваются на одноцепочечных нуклеотидных последовательностях ДНК-мишени в соответствии с правилами спаривания оснований.
Это обыкновенная зависящая от температуры реакция ДНК : ДНК гибридизации которая нуждается в оптимизации.
Это единственная стадия ПЦР амплификации ДНК температура которой может варьировать в широких пределах.
Температура этой стадии зависит от точной последовательности и длины праймеров.
Обычно реакционную ПЦР смесь охлаждают до 40-60°С.
Тем не менее, температуры отжига для ДНК-шаблонов с высоким содержанием GC пар могут достигать 72°C (нормальная температура этапа элонгации).
Температура для этой стадии ПЦР выбирается для оптимального связывания праймеров с подходящим шаблоном ДНК и зависит от температуры плавления праймеров.
Неудачно подобранная температура отжига может приводить к появлению ложных продуктов реакции или вообще не давать результатов.
Так как праймеры относительно короткие и находятся при высоких молярных концентрациях продолжительность стадии отжига составляет около 30 секунд.
На этой стадии отожженные олигонуклеотиды обеспечивают свободную 3'-гидроксильную группу для Taq ДНК-полимеразы и действуют как праймеры для синтеза ДНК.
Этап ПЦР элонгации (синтеза).
Последний из 3 основных этапов ПЦР является шагом элонгации или синтеза.
Это стадия ДНК проводится термостабильной ДНК-полимеразой.
Температуру стадии элонгации обычно устанавливают на 72°C. Она немного ниже оптимальной для Taq ДНК-полимеразы.
Taq-полимераза синтезирует комплементарные нити ДНК, начиная с праймеров.
Скорость синтеза составляет примерно 1000 пар оснований в минуту.
Поэтому для амплификации ДНК-шаблона, который имеет длину 500 оснований, при нормальных условиях время этапа ПЦР элонгации должно составлять не менее 30 секунд.
Обычно для синтеза каждых 500 пар оснований ДНК матрицы требуется 30 секунд.
Циклы ПЦР амплификации
В течение самого первого цикла полимеразной цепной реакции единственными шаблонами, доступными для отжига праймеров, являются участки исходной ДНК, полученной из соответствующего источника.
Поскольку исходный ДНК шаблон во много раз превышает длину требуемого ампликона, полимеризация первого цикла будет продолжаться до тех пор, пока она не будет прервана на стадии денатурации второго цикла ПЦР.
В конце первого цикла полимеразной цепной реакции на каждую двухцепочечную ДНК, с которой началась реакция, приходится две новых молекулы двухцепочечной ДНК.
Каждая из них содержит одну нить исходного шаблона и одну новую нить, которая ограничена на одном конце олигонуклеотидным праймером, а с другой стороны - тем, насколько полимеризация (синтез ДНК) могла протекать во время этапа элонгации.
Эти продукты полимеразной цепной реакции образуют ДНК-шаблоны, которые ограничены только на одном конце (semi-bounded DNAs).
Во втором цикле как исходные мишени ДНК, так и ограниченные на одном конце ДНК будут служить в качестве шаблонов.
Исходные ДНК-шаблоны будут продолжать производить ограниченные на одном конце ДНК в каждом цикле ПЦР реакции.
Начиная со второго цикла ПЦР ДНК амплификации, ограниченные на одном конце ДНК будут образовывать продукты ПЦР - ампликоны.
В каждом последующем цикле исходные шаблоны ДНК, ограниченные на одном конце ДНК и ампликоны будут служить в качестве шаблонов для праймеров ПЦР.
В реакционной смеси ПЦР:
- количество матричной ДНК не изменяется;
- количество ограниченные на одном конце шаблонов ДНК увеличивается арифметически каждый цикл;
- число ампликонов увеличивается геометрически каждый цикл, начинающийся с цикла 2.
В конце 35 циклов ПЦР на каждую исходную последовательность ДНК-шаблона приходиться более 34 миллиардов копий ДНК-ампликонов.
Разработка программируемого термоциклера помогла расапространению ПЦР технологии.
Программируемый термоциклер основан на металлических нагревательных блоках с отверстиями для пробирок и предназначен для переключения между запрограммированной последовательностью температур ПЦР шагов.
Ссылки:
- Variants of PCR – Wikipedia
- PCR Protocol for Taq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer – New England Biolabs
- PCR Technique with its Application – RESEARCH & REVIEWS - INTERNATIONAL JOURNALS
- PCR Protocols & Applications – QIAGEN
- PCR Cycling Parameters—Six Key Considerations for Success – Thermo Fisher Scientific
