Полимеразная цепная реакция была впервые разработана в 1983 году Кари Муллисом. На сегодняшний день существует много разных видов ПЦР.
Некоторыми из них являются – RT-PCR (ПЦР с обратной транскрипцией), touchdown PCR, real time PCR (ПЦР в реальном времени), nested PCR («вложенная» ПЦР), Strand Displacement Amplification (амплификаци со смещением нити), Rolling Circle Amplification (амплификация катящегося кольца), Ligase Chain Reaction, Helicase Dependent DNA amplification и т.д.
Двумя группами различных видов полимеразной цепной реакции являются термоциклические методы ПЦР и методы изотермической амплификации.
Различные виды ПЦР-методов, основанных на термоциклировании (стадии нагревания и охлаждения)
Методы термоциклирования используют циклическое чередование температуры для повторения ДНК синтеза.
Множественная ПЦР (Multiplex PCR)
Мультиплексная ПЦР представляет собой метод ПЦР, который позволяет одновременно амплифицировать множество последовательностей мишеней в одной и той же реакционной смеси.
Так как одна реакционная смесь включает в себя наборы пар праймеров для разных ДНК целей, то это уменьшает потребление реагентов ПЦР и в то же время налагает определенные ограничения на используемые праймеры.
Для одновременной работы в одной реакционной смеси наборы праймеров должны быть оптимизированы.
Они должны иметь одинаковые температуры отжига и производить продукты амплификации (ампликоны) разного размера с образованием четко различимых гель-электрофорезных полос для последующего ПЦР-анализа.
«Гнездовая» или вложенная ПЦР (Nested PCR)
Вложенная ПЦР используется для увеличения специфичности амплификации ДНК путем уменьшения числа побочных продуктов реакции.
В этом методе используются два набора праймеров.
Первый набор обеспечивает первую полимеразную цепную реакцию. Продукт этой реакции служит источником ДНК-мишени для второй ПЦР с использованием второго набора праймеров.
Лигазная цепная реакция (Ligase Chain Reaction, LCR)
Праймеры лигазной цепной реакции намного длиннее, чем обычные праймеры для ПЦР, и предназначены для покрытия всей последовательности, подлежащей амплификации.
На первой стадии отжига праймеры сшивают термостабильной ДНК-лигазой.
Это генерирует фрагмент, который состоит из пары праймеров и служит в качестве шаблона для последующих циклов.
Основным преимуществом лигазной цепной реакции является то, что одноточечная мутация в исходной матричной ДНК может предотвратить реакцию и отсутствие продукта может быть индикатором мутаций.
Количественная ПЦР (Quantitative PCR, qPCR)
Количество продукта, которое синтезируется в течение заданного количества циклов ПЦР, зависит от количества молекул ДНК, которые присутствуют в исходной смеси. Это позволяет использовать ПЦР для количественного определения количества молекул ДНК, присутствующих в экстракте.
В количественной ПЦР количество продукта, синтезированного во время тестовой ПЦР, сравнивают с количествами, синтезированными во время ПЦР, с известными количествами исходной ДНК.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR)
Сегодня квантификация ПЦР проводится в реальном времени - модификация стандартного метода ПЦР, в котором синтез продукта измеряется с течением времени.
Чаще всего этот метод используется для измерения количества РНК. Например, чтобы определить экспрессию конкретного гена в раковых клетках. Этот метод позволяет контролировать развитие рака.
ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR)
Для проведения ПЦР, где РНК является исходным материалом, этот метод ПЦР использует обратную транскриптазу, процесс, называемый ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR).
Первым шагом в этом методе является превращение молекул РНК в одноцепочечную комплементарную ДНК (кДНК). После этого этапа эксперимент протекает так же, как в стандартной методике.
Некоторые термостабильные полимеразы, такие как Tth, обладают обратной транскриптазной активностью в определенных буферных условиях и способны копировать как РНК, так и ДНК молекулы.
Различные виды ПЦР-методов, основанных на изотермической амплификации ДНК
Изотермические методы не зависят от термоциклирования. С ними легче работать и они требуют меньше энергии, чем стандартные методы ПЦР.
Изотермические методы используют ДНК-полимеразы с активностью cмещения нитей.
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
ПЦР-реакционная смесь для Loop-mediated isothermal amplification имеет ДНК-полимеразу с активностью cмещения нитей вместо Taq-полимеразы. Для проведения реакции смесь выдерживают при постоянной температуре (около 65°С).
Репликация по типу катящегося кольца (Rolling Circle Amplification, RCA)
При репликации по типу катящегося кольца сначала два конца ДНК мишени объединяются вместе с использованием ДНК-лигазы для образования круглого одноцепочечного шаблона. Праймер прикрепляют к этому ДНК шаблону во время отжига. Амплификация выполняется до завершения синтеза круга. Синтезированная цепь смещается из-за свойства полимеразы с активностью cмещения нитей.
Основное преимущество заключается в том, что синтез может происходить при комнатной температуре.
Хеликаз зависимая ДНК амплификация (Helicase-Dependent DNA Amplification, HDA)
Хеликаз зависимая ДНК амплификация зависит от активности ДНК-хеликазы для разделения двухцепочечной ДНК.
Основное преимущество заключается в том, что хеликаза может работать при комнатной температуре.
