Генная инженерия - использование технологий создания рекомбинантной ДНК для модификации генома организма с целью достижения желаемых признаков (черт).
Технология рекомбинантной ДНК - это технология объединения молекул ДНК из разных видов с помощью лабораторных методов генетической рекомбинации. Результатом этих генетических манипуляций является молекула или вектор рекомбинантной ДНК (рДНК).
Добавление чужеродной ДНК в форме рекомбинантных ДНК-векторов, которые генерируются путем молекулярного клонирования, является наиболее распространенным методом генной инженерии.
Организм, который получает рекомбинантную ДНК, называется генетически модифицированным организмом (ГМО).
Когда вводится чужая ДНК, имеющая происхождение от другого вида, организм-хозяин называется трансгенным.
Химера
Сегодня генетики часто используют термин «химера» для описания генетически модифицированных организмов, которые содержат гены неродственных видов.
Первый химерный организм был создан в 1973 году, когда Стэнли Коэн (Stanley Cohen) и Герберт Бойер (Herbert Boyer) успешно разработали бактериальную плазмиду, которая могла экспрессировать ген амфибий.
Технология рекомбинантной ДНК
Чтобы вставить ген млекопитающего в прокариотическую клетку, должны быть выполнены два основных требования.
Во-первых, исследователи должны выделить нужный ген из целого генома.
Во-вторых, исследователи должны найти способ гарантировать, что прокариотическая клетка может правильно экспрессировать ген млекопитающих.
Создание и выделение гена для клонирования
Эукариотическая хромосома и отобранные бактериальные плазмиды, которые должны использоваться в качестве вектора, обрабатываются рестрикционной эндонуклеазой.
Когда эукариотические фрагменты ДНК соединяются с разорванными плазмидами, некоторые из плазмид рекомбинируют с эукариотической ДНК.
Затем плазмиды возвращаются бактериям-хозяевам путем культивирования в растворе таким образом, что некоторые из бактерий поглощают плазмиды.
Однако многие плазмиды не содержат рекомбинантную ДНК, а из тех, которые содержат, только небольшая часть имеет в своем составе нужный (целевой) ген млекопитающих. Поэтому следующим шагом является выделение бактериальных колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды с необходимым геном.
Этот шаг включает в себя два этапа скрининга:
Этап 1: Определение бактериальных колоний, которые содержат рекомбинантные плазмиды.
Только часть бактерий содержит в себе рекомбинантные плазмиды. Чтобы определить такие колонии, исследователи обычно используют плазмиды, несущие определенный генетический маркер, то есть черту, которая легко идентифицируется.
Этап 2: Определение бактерий, содержащих желаемый ген.
Когда ДНК млекопитающего разрушается эндонуклеазой, результатом могут быть сотни или тысячи фрагментов. Из них только небольшая часть будет содержать ген-мишень.
В результате требуется еще один шаг чтобы найти те бактерии, которые содержат плазмиду, имеющую нужный ген.
Идентификация этих бактерий включает в себя использование технологии гибридизации нуклеиновых кислот.
Если по крайней мере часть последовательности нуклеиновой кислоты нужного гена известна, эту информацию можно использовать для конструирования зонда из РНК или одноцепочечной ДНК. Зонд состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарной известной последовательности гена, а также радиоактивную или флуоресцентную метку.
При использовании зонда ДНК из каждой бактериальной колонии сначала нагревают, чтобы отделить друг от друга две ее цепи, а затем смешивают с раствором, содержащим зонд.
Зонд формирует спаренные основания с его комплементарной последовательностью ДНК, что дает возможность исследователям определить местонахождение метки, чтобы определить какая бактериальная колония содержит желаемый ген.
Как только колония идентифицирована, ее можно культивировать для получения генного продукта.
Экспрессирование генов эукариот в прокариотических векторах
Во-первых, промоторная последовательность эукариотического гена не будет распознаваться РНК-полимеразой из прокариот.
Чтобы преодолеть эту проблему, исследователи разработали особый тип плазмиды, называемый вектором экспрессии (expression vector).
Экспрессионный вектор представляет собой плазмиду, которая содержит прокариотическую промоторную последовательность непосредственно перед тем местом, которое узнается рестриктазой.
Таким образом, когда происходит рекомбинация, вставленная последовательность ДНК будет лежать близко к бактериальному промотору. Затем клетка-хозяин распознает промотор и транскрибирует ген.
Во вторых, прокариоты не содержат малые ядерные РНК (Small nuclear ribonucleic acid, snRNA) или сплайсосомы (spliceosomes), необходимые для удаления интронов из эукариотического пре-мРНК-транскрипта.
Это означает, что транскрипт мРНК в прокариоте будет содержать как кодирующие, так и некодирующие последовательности, которые будут транслироваться клеткой.
Решение этой проблемы заключалось в разработке искусственных эукариотических генов, не содержащих интронов.
Исследователи сначала изолируют готовую мРНК от цитоплазмы эукариотической клетки. Затем мРНК помещают в раствор с ферментом, называемым обратной транскриптазой, который создает цепь ДНК, комплементарную цепи мРНК. Эту ДНК-цепь затем выделяют и добавляют к раствору, содержащему ДНК-полимеразу, которая синтезирует другую комплементарную цепь ДНК. В результате получается двухцепочечная молекула ДНК, содержащая только кодирующие части эукариотического гена. Эта синтетическая молекула называется комплементарной ДНК или кДНК (cDNA).
Другим решением обеих этих проблем является использование эукариотических клеток в качестве клонирующих векторов. Дрожжевые клетки часто используются для этой цели, так как их легко культивировать. Некоторые дрожжевые клетки также содержат плазмиды, поэтому подобные способы могут быть использованы для вставки рекомбинантной ДНК в вектор клонирования.
Вставка ДНК в растительные или животные векторы
В некоторых случаях только растительные или животные клетки будут содержать все ферменты, необходимые для правильного производства желаемого белка. Такие клетки могут быть выращены в культурах, чтобы служить векторами клонирования.
Однако, поскольку эти клетки труднее культивировать, то и сложности вставки чужеродной ДНК, соответственно, возрастают.
Чтобы обойти этот очевидный барьер и поместить чужеродные гены в эукариотические геномы, биологи разработали и используют несколько методов.
- Ti (опухолеобразующая) плазмида
- Кратковременный электрический ток
- Генная пушка (DNA particle gun)
